CONTENTS
List of contributors  ... xv
Abbreviations  ... xvii
1 One-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis  / B. David Homes ... ⅰ
  1. Introduction  ... 1
  2. Why polyacrylamide gel?  ... 1
  3. Properties of polyacrylamide gel  ... 3
    Chemical structure  ... 3
    Polymerization catalysts  ... 3
    Effective pore size  ... 5
  4. Experimental approach  ... 6
    Rod or slab gels  ... 6
    Dissociating or non-dissociating buffer system  ... 7
    Continuous or discontinuous (multiphasic) buffer system  ... 9
    Choice of pH  ... 13
    Choice of polymerization catalyst  ... 14
    Choice of gel concentration  ... 14
    Molecular mass estimation  ... 16
  5. Apparatus  ... 22
    Gel holders and elecirophoresis tanks  ... 22
    Additional items of equipment required for electrophoresis  ... 27
  6. Preparation and electrophoresis of polyacrylamide gels  ... 30
    Reagents  ... 30
    Stock solutions  ... 31
    Gel mixture preparation  ... 32
    Preparation of rod gels  ... 38
    Preparation of slab gels  ... 41
    Sample preparation  ... 44
    Sample loading and electrophoresis  ... 49
  7. Analysis of gels following electrophoresis  ... 51
    Recovery of gels  ... 51
    Protein staining with organic dyes and quantitation  ... 52
    Silver staining  ... 60
    Fluorescent protein labels  ... 67
    Detection of radioactive proteins  ... 68
    Detection of glycoproteins  ... 81
    Detection of phosphoproteins  ... 82
    Detection of proteins using immunological methods  ... 83
    Detection of enzymes  ... 83
    Blotting techniques  ... 85
  8.Recovery of separated proteins  ... 97
    Localization of protein bands  ... 99
    Elution of proteins  ... 101
    The recovery of proteins from electroblots  ... 103
  9. Modifications to the basic techniques  ... 103
    Molecular mass analysis of oligopeptides  ... 103
    Separation of special classes of proteins  ... 108
    Concentration gradient gels  ... 116
    Transverse gradient gel electrophoresis  ... 124
    Micro- and mini-gels  ... 125
    Large numbers of gels  ... 127
    Agarose／acrylamide composite gels  ... 130
    Affinity electrophoresis  ... 130
  10. Homogeneity and identity  ... 130
    Homogeneity of separated proteins  ... 130
    Further characterization of separated proteins  ... 131
  11. Artefacts and troubleshooting  ... 136
  Acknowledgements  ... 139
  References  ... 139
2 Isoelectric focusing  / Pier Giorgi Righetti ; Elisabetta Gianzza ; Cecil ... 149
  1.Introduction  ... 149
  2.Conventional IEF in amphoteric buffers  ... 149
    General considerations  ... 149
    Equipment  ... 154
    The polyacrylamide gel matrix  ... 157
    Gel preparation and electrophoresis  ... 162
    General protein staining  ... 173
    Specific protein detection methods  ... 176
    Quantitation of the focused bands  ... 176
    Troubleshooting  ... 177
    Preparative aspects  ... 178
  3.Immobilized pH gradients  ... 181
    General considerations  ... 181
    IPG methodology  ... 196
    Troubleshooting  ... 206
    Some analytical results with IPGs  ... 206
    Preparative aspects of IPGs  ... 208
  4.Conclusions  ... 214
  Acknowledgements  ... 214
  References  ... 214
3 Two-dimensional gel electrophoresis  / David Rickwood ; J: Alec A. Chambers ; S. Peter S ... 217
  1. Introduction  ... 217
  2. Apparatus for two-dimensional electrophoresis  ... 218
    Introduction  ... 218
    Apparatus for first-dimensional gels  ... 218
    Apparatus for second-dimensional gels  ... 219
  3. General aspects of two-dimensional gel electrophoresis  ... 220
    Introduction  ... 220
    Solutions and apparatus  ... 222
    Preparation of the sample  ... 223
    Preparation and electrophoresis of gels  ... 224
  4. Two-dimensional separations of proteins on the basis of their isoelectric points and mobility in SDS - polyacrylamide gels  ... 228
    Introduction  ... 228
    First-dimensional separation by isoelectric focusing  ... 229
    Second-dimensional separation by SDS -polyacrylamide gel electrophoresis  ... 236
    Modifications to the basic method  ... 241
    Factors affecting separation: problems and troubleshooting  ... 245
  5. Separation of special classes of proteins  ... 250
    Introduction  ... 250
    Ribosomal proteins  ... 250
    Histones  ... 253
    Chromatin non-histone proteins  ... 256
  6. Quantifying two-dimensional gel patterns  ... 259
    Introduction  ... 259
    Primary data from gels  ... 261
    Types of gel scanner  ... 261
    Numerical analysis of gel patterns  ... 264
    Conclusions  ... 269
  Acknowledgements  ... 270
  References  ... 270
4 Immunoelectrophoresis  / T. C. B φ g-Hansen ... 273
  1. Introduction  ... 273
  2. Basic techniques and their applications  ... 274
    Equipment  ... 274
    Gel preparation  ... 279
    Electrophoresis  ... 280
    Inspection  ... 281
    Pressing, washing, and drying  ... 281
    Staining and destaining  ... 282
  3. Image processing  ... 283
    Hardware and storage  ... 284
    Image processing and pattern recognition  ... 284
    Applications of image processing  ... 285
  4. Immunoelectrophoresis  ... 285
    Purpose  ... 285
    Principle  ... 285
    Procedure  ... 286
    Modifications for identification of specific antigens or antibodies  ... 287
  5. Crossed immunoelectrophoresis  ... 287
    Purpose  ... 287
    Principle  ... 287
    Procedure  ... 288
  6. Rocket immunoelectrophoresis, electroimmunoassay  ... 290
    Purpose  ... 290
    Principle  ... 290
    Procedure  ... 291
  7. Fused rocket immunoelectrophoresis  ... 292
    Purpose  ... 292
    Principle  ... 292
    Procedure  ... 292
    Applications  ... 293
  8. Intermediate gel technique  ... 294
    Purpose  ... 294
    Principle  ... 294
    Procedure  ... 294
    Applications  ... 294
  9. Line immunoelectrophoresis  ... 296
    Purpose  ... 296
    Principle  ... 296
    Procedure  ... 297
    Applications  ... 297
  10. Line immunoelectrophoresis with in situ absorption  ... 297
    Purpose  ... 297
    Principle  ... 297
    Procedure  ... 298
    Applications  ... 298
  11. Detection of biological activity  ... 299
    References  ... 299
5 Peptide mapping  / Anthony T. Andrews ... 301
  1. Introduction  ... 301
  2. Apparatus  ... 303
  3. Methodology  ... 305
    The standard technique  ... 305
    Variations of the standard technique  ... 309
    Peptide mapping of protein mixtures  ... 312
    Characterization of proteinases  ... 313
  4. Interpretation of results  ... 316
  References  ... 318
Appendices
  A1. Suppliers of specialist items for electrophoresis  / B. D. Hames ... 321
  A2. Bibliography of polypeptide detection methods  / B. D. Hames ... 324
  A3. Reagents for the tisotopic labelling of proteins  / D. Rickwood
  A4. Molecular masses and isoelectric points of selected marker proteins  / B. D. Hames ... 359
  A5. Applications of two-dimensional gel electrophoresis  / J. Alec Chambers ; D. Rickwood ... 352
  A6. Production of polyvalent antibodies for immunoelectrophoresis  / R. D. Jurd ; T. C. B φ g-Hansen ... 366
Index  ... 377