목차 일부
1장. PCR을 이용한 사람 유전자의 돌연변이 규명 ... 15
1. PCR을 위한 시료 준비 ... 20
1.1 혈액으로부터의 Genomic DNA 분리
1.2 Kit을 이용해서 쉽게 DNA를 얻는 방법
2. Polymerase Chain Reaction ... 24
3. Subcloning of PCR Product...
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목차 전체
1장. PCR을 이용한 사람 유전자의 돌연변이 규명 ... 15
1. PCR을 위한 시료 준비 ... 20
1.1 혈액으로부터의 Genomic DNA 분리
1.2 Kit을 이용해서 쉽게 DNA를 얻는 방법
2. Polymerase Chain Reaction ... 24
3. Subcloning of PCR Products ... 28
2장. RT-PCR : Reverse Transcription-PCR ... 33
1. RNA 분리과정 ... 34
2. cDNA 합성 : Reverse Transcription ... 34
3. PCR Amplification ... 35
3장. Real Time PCR 방법을 이용한 mRNA 정량 ... 37
1. cDNA 만들기 ... 38
2. PCR Reaction Mix ... 38
3. Real Time PCR 과정 ... 41
4. 결과 분석 ... 42
4장. PCR의 응용 ... 43
1. Pathogen의 검출 ... 43
2. Human Genetics(인체 유전학) ... 43
3. Evolutionary Biology(진화 생물학) ... 44
4. Genetic Fingerprinting ... 44
5장. DNA Preparation from E. coli ... 45
1. Competent Cell 만들기 ... 45
2. Transfection과 Single Strand DNA 분리 ... 46
2.1 Transfection
2.2 Single Strand DNA 분리
3. Transformation과 Plasmid DNA 분리 ... 55
3.1 Transformation
3.2 Alkaline Lysis 방법에 의한 Plasmid DNA 분리
6장. DNA Sequencing ... 61
1. Sequenase를 이용한 DNA sequencing ... 63
1.1 Annealing
1.2 Labeling Reaction
1.3 Termination Reaction
2. PCR Product의 Direct Sequencing ... 69
2.1 PCR 산물의 전처리
2.2 Sequencing Reaction
3. Sequencing Gel 준비 ... 71
3.1 Gel 유리판 준비
3.2 Gel Solution 준비(6Polyacrylamide, Denaturing Gel)
3.3 Gel 붓기
4. Sequencing Gel Electrophoresis ... 74
5. Sequencing Service Center : Automatic Capillary Type Instruments ... 78
5.1 BigDye Terminator Reaction
5.2 Cyclic Sequencing Reaction
5.3 Precipitation-Resuspension
5.4 Capillary Electrophoresis
5.5 Sequencing 결과에 영향을 미치는 요인
7장. Southern Hybridization ... 83
1. 혈액으로부터 Genomic DNA의 분리 ... 84
2. Southern Hybridization을 이용한 DNA 분석 ... 87
2.1 Restriction Enzyme Digestion
2.2 Agarose Gel Electrophoresis : Blotting할 Gel
2.3 Processing the Gel
2.4 Denatured DNA를 NC Filter로 옮기기
2.5 Hybridization
2.6 Washing
2.7 Signal Generation／Detection
8장. Northern Hybridization ... 99
1. Total RNA Isolation from Tissue ... 101
1.1 Guanidinium Method에 의한 Total RNA 분리
1.2 Single-Step RNA Isolation
2. Northern Blotting ... 106
2.1 Glyoxal／DMSO를 이용한 Denaturing Gel Electrophoresis
2.2 Formaldehyde를 이용한 RNA의 Denaturing Gel Electrophoresis
2.3 Denatured RNA를 NC Filter로 옮기기
2.4 Hybridization
9장. Probe 만들기 ... 115
1. Random Primer Extension 방법 ... 116
1.1 Annealing
1.2 Polymerization
1.3 Spun-Column Chromatography
2. T4 Polynucleotide Kinase를 이용한 DNA의 5' 말단 Labeling ... 118
2.1 Dephosphorylation
2.2 Kination
3. Nick Translation ... 121
4. Single Strand DNA Probe 만들기 ... 123
4.1 Annealing
4.2 Labeling Reaction
4.3 Probe의 분리
4.4 Electroelution
10장. 단백질 생산 ... 131
1. 소 혈액으로부터 단백질(Thrombin) 정제 ... 132
2. E. coli로부터 Pfu Polymerase 발현 및 정제 ... 138
3. In vitro Transcription and Translation(Wheat Germ Extract System) ... 144
3.1 RNA 합성(in vitro Transcription)
3.2 RNA 정제
3.3 단백질 합성(in vitro Translation)
11장. Polyclonal Antibody의 제조 ... 149
1. Immunization of Rabbit ... 149
1.1 깨끗하게 정제된 Antigen의 경우
1.2 정제가 덜 된 Antigen의 경우
2. Serum Test ... 150
3. Bleeding ... 151
3.1 심장 채혈 방법(Heart Puncture)
3.2 귀로부터 채혈하는 방법
12장. Western Blotting ... 153
1. SDS Polyacrylamide Gel 만들기 ... 154
2. Sample 준비 ... 156
3. Gel Electrophoresis ... 157
4. Electrotransfer ... 159
13장. ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Detection of Antibodies ... 163
14장. Ouchterlony Double-Diffusion Test ... 167
15장. 단일클론 항체 만들기 ... 169
1. Immunization of Mice ... 169
2. Preparation of Myeloma cells ... 170
3. Preparation of Mouse Feeder Cell ... 171
4. Fusion ... 173
5. Cloning of Hybridoma Cell Lines by Limited Dilution ... 178
6. Freezing and Recovery of Hybridoma Cell Lines ... 179
6.1 Freezing
6.2 Recovery
7. Production of Ascites Fluids ... 182
16장. Site-Directed Mutagenesis ... 185
1. U-template를 응용한 고효율 Mutagenesis ... 186
1.1 U-template의 제작
1.2 Synthesis of Mutagenic Strand
2. PCR을 응용한 Mutagenesis ... 192
2.1 Dpnl Digestion을 이용한 Mutagenesis
2.2 Overlap Extension을 이용한 Mutagenesis
17장. cDNA Library Screening ... 199
1. Preparation of Plating Bacteria ... 200
2. Titer ... 200
3. Plating ... 202
4. Immobilizaton of λ DNA on Nitrocellulose (NC) Filter ... 203
5. Hybridization ... 204
6. Washing ... 205
7. Picking up an Isolated Plaque ... 206
8. 2차 Screening ... 207
9. Purification of λ Phage DNA ... 207
18장. Animal Cell Culture and Tronsfection ... 213
1. Animal cell culture 방법 ... 214
1.1 동결세포의 해동(Thawing)
1.2 Subculture
1.3 세포의 동결보존(Freezing)
1.4 Transfection(Calcium, Liposome, Electroporation)
19장. FACS를 이용한 Cell Cycle 분석 ... 227
1 Cell 준비 ... 228
1.1 배지에 떠다니며 자라는 세포 또는 혈액 샘플의 경우
1.2 바닥에 붙어서 자라는 세포의 경우
2. Propidium Iodide로 염색하는 방법 ... 229
2.1 세포 고정
2.2 염색(Propidium Iodide)
2.3 FACS로 측정
3. DAPI로 염색하는 방법 ... 232
3.1 세포 고정
3.2 염색(DAPI)
3.3 FACS로 측정
4. Hoechst 33342로 살아있는 세포를 염색하는 방법 ... 234
4.1 세포 준비
4.2 염색(Hoechst 33342)
4.3 FACS로 측정
5. DNA의 양과 Cyclin의 발현량을 동시에 분석 ... 235
5.1 세포 고정
5.2 Anti-cyclin Primary Antibody를 붙이는 과정
5.3 FITC-conjugated Secondary Antibody를 붙이는 과정
5.4 염색(Propidium Iodide)
5.5 FACS로 측정
20장. RNase Protection Asscy(RPA) ... 241
1. Total RNA Isolation ... 242
2. Probe 만들기와 정제하기 ... 245
3. Procedure(RNase Protection Assay) ... 245
21장. C. elegans(예쁜 꼬마 선충)를 이용한 유전자의 in vivo 기능 연구 ... 249
1. Competent Cell(E. coli HT115) 만들기 ... 250
2. dsRNA 생성 Vector에 Cloning하기 ... 250
3. C. elegans에서 RNAi하기 ... 251
4. Antibody Staining ... 253
5. 결과 분석 ... 258
22장. In situ Hybridization 초파리 배아에서 유전자 mRNA 검색 ... 261
1. RNA Probe 만들기 ... 262
2. 초파리 배아(Embryo) 모으기 ... 265
3. In situ Hybridization전 배아의 사전처리 ... 269
4. Hybridization ... 272
5. Detection ... 274
23장. 형질전환 초파리 Library 검색하기 ... 277
1. Human 단백질 Sequence의 확보 ... 278
24장. Yeast : 유전자 적중 Library를 이용한 HCS 약물 작용점 탐색 및 Synthetic Lethality를 통한 Genetic Pathway 규명 ... 289
1. 서론 : 약물작용점 탐색 방법 ... 289
2. 효모를 이용한 in vivo Cell-based 약물작용점 탐색 방법 ... 290
3. 분열효모와 출아효모 ... 292
4. 분열효모의 Haploinsufficiency를 이용한 in vivo Cell-based 약물작용점 탐색 시스템 ... 293
4.1 유전자 적중 분열효모 균주의 제조
4.2 유전자 적중 균주의 데이터베이스
4.3 세포성장민감성(Growth Fitness)을 이용한 약물작용점 탐색 : 화합물의 약물 작용점
4.4 Microarray를 이용한 약물작용점 탐색 : 천연물의 약물작용점
5. Synthetic Lethality를 통한 Genetic Pathway의 규명 ... 298
5.1 효모를 이용한 Synthetic Lethality의 개요
5.2 Genome Wide 유전자 적중 효모를 이용한 Synthetic Lethality
6. Genome Wide 유전자 적중 분열효모 100활용하기 ... 300
6.1 약물작용점 탐색분야
6.2 Synthetic Lethality
6.3 개별 유전자 기능연구
7. 맺음말 ... 303
25장. Confocal Microscopy ... 305
1. LSCM의 개발과 원리 ... 306
2. Confocal Microscope의 활용 ... 307
3. Confocal Microscope 사용시 고려할 사항 ... 309
26장. 박편제작(薄片製作, Microtomy) ... 313
1. 파라핀 박편제작 ... 314
2. 플라스틱 박편제작 ... 317
3. 냉동 박편제작(Cryostat Section) ... 321
27장. 형질전환 생쥐 ... 325
1. Preparation of DNA for Microinjection ... 325
2. Microinjection of Foreign DNA ... 331
3. 생쥐 수정란의 이식 ... 335
28장. Gene Targeting ... 339
1. Preparation of Mouse Embryonic Fibroblasts(MEF) ... 339
2. Preparation of Feeder Layer ... 343
3. Maintenance of Embryonic Stem(ES) Cells ... 344
4. Electroporation of ES Cells ... 347
5. Production of Chimeras Derived from ES Cells ... 348
29장. 인간 배아줄기세포(Human Embryonic Stem Cells) ... 351
1. 인간 배아줄기세포의 확립 ... 352
1.1 Mechanical Isolation 방법
1.2 Immunosurgery 방법
2. 인간 배아줄기세포의 유지 ... 353
2.1 Feeder Cells의 증식
2.2 Feeder Layer의 준비
2.3 인간 배아줄기세포의 계대배양
2.4 인간 배아줄기세포의 동결보존
2.5 인간 배아줄기세포의 융해
3. Human Embryoid Body의 제작 ... 362
4. 인간 배아줄기세포의 특성분석 ... 365
4.1 Alkaline Phosphatase Staining
4.2 SSEA-1, 3, & 4에 대한 Immunocytochemistry
4.3 Oct-3／4에 대한 Immunocytochemistry
4.4 Teratoma Formation
30장. Bioinformatics-컴퓨터를 이용한 생물학 ... 371
1. SRS에 대하여 ... 372
1.1 SRS란 무엇인가?
1.2 SRS의 전체 구성
2. SRS를 이용한 CDK2 유전자 연구 ... 375
2.1 사람 CDK2 유전자 검색
2.2 여러 종의 CDK2 유전자 서열 비교
2.3 사람 CDK 유전자들의 서열 비교
2.4 기타 SRS에 대하여
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